常用的几种PCR方法的策略（三）
长片段 PCR
长片段PCR通常是指扩增大于5kb的DNA片段。长片段PCR传统上使用 Taq DNA 聚合酶（用于快速延伸）和高保真酶（用
于提高准确性）的混合物。
随着具有高合成能力的高保真DNA聚合酶被发明出来，现在能够在更短的时间内实现更准确的长片段PCR。通过在DNA聚合
酶中设计一个较强的DNA结合结构域，从而使其能够在短时间内扩增长片段（如，来自gDNA的 >20 kb 片段），实现高合
成能力。此外，极高的保真度（如， Taq 聚合酶保真度的 >100倍）还有助于确保长片段扩增的低错误率。
表 .在长片段PCR和克隆中使用高合成能力高保真DNA聚合酶的优势。
DNA聚合酶的高合成能力可显著缩短长片段PCR的反应时间（在本例中，时间缩短了一半），而高保真度可减少筛选含正确
插入片段克隆的工作量。
什么是高保真PCR？
当扩增>10 kb的目的片段时，应根据以下5个关键点对PCR方案进行优化：
1. 确保使用高质量、高纯度的DNA样本。
2. 如果DNA聚合酶的热稳定性较低，则需要使用更多量的酶，以弥补因延长循环时间导致的活性损失。
3. 降低退火和延伸步骤的温度，有助于引物结合。
4. 适当延长PCR步骤的持续时间，有助于模板DNA的完全解离及引物的结合。
5. 适当延长PCR延伸时间，可确保目标区域的全长复制。
反向PCR
反向PCR起初设计用于确定邻近未知区域的序列。它有助于研究基因的启动子序列；致癌性染色体重排，如基因融合、易位
和转座；以及病毒基因整合。该方法之所以被称为反向PCR，是因为引物设计用于向两边延伸而不像常规PCR中朝着彼此延
伸。如今，反向PCR常被用于定点突变，复制一个具有预期突变的质粒。
在研究基因组DNA未知序列的传统工作流程中，首先进行限制性酶切消化和连接，再进行反向PCR，随后对PCR扩增子进行
测序。对于gDNA消化，需选用一种限制性内切酶进行酶切，以获得长度合适且能够自我连接的片段。
同时，选定的限制性内切酶不可剪切已知序列，从而使连接发生于侧翼未知序列之间。使用低浓度的酶切DNA片段优化连接
步骤，使其倾向于自我连接而非多片段连接（即形成连环体）。
完成自我连接后，从DNA的已知区域启动反向PCR。所获得的扩增子每个末端都含有部分已知DNA序列。随后，可从末端开
始对这些扩增子进行测序，检测上述已知序列的相邻区域。
定量PCR
序列的扩增程度（得率）取决于模板起始量，PCR常用于对样品中的DNA进行定量，其中，最常见的应用是基因表达定量。
终点PCR方法虽然可行，但它存在一重大缺点，即需要通过凝胶电泳确定得率，从而限制了检测灵敏度。
此外，定量是在PCR末期进行的，而此时的扩增已达到平台期，因此，DNA凝胶染色强度无法与DNA起始量呈线性相关。尽
管如此，若在到达平台期之前通过终点PCR对基因表达进行半定量分析，可使用连续稀释的DNA样品作为起始物，或收集指
定PCR循环的扩增子，并根据凝胶染色强度估计基因表达量。
直到1993年，Higuchi等报道称使用荧光信号对PCR扩增进行实时监测，才克服了终点PCR定量的局限性。这一技术为我们
今天所熟知的定量PCR(qPCR）奠定了基础。1997年，第一款qPCR仪进入市场，使PCR能够准确定量基因表达和拷贝数。
qPCR依靠对指数期目的片段扩增荧光信号的实时监测，克服了终点PCR定量的缺点。尽管qPCR能够定量检测相对和绝对基
因表达，但是其检测能力限制了定量性能。
20世纪90年代与实时荧光定量PCR同时开发的数字PCR （也称为极限稀释PCR）实现了真正的DNA样品绝对定量。在数字
PCR中，是将高度稀释的DNA样品分配到多区室芯片中，使每个区室最多含有一个拷贝的靶标。然后，对每个区室内的扩增
进行检测，获得阳性或阴性结果（分别为1或0个模板拷贝；即， "数字" 结果）。
最后，使用统计模型（泊松分布），根据阴性反应部分确定样品的拷贝数，无需定量已知样品（标准品）。除了基因表达和
拷贝数定量，数字PCR还适用于区分低频等位基因、病毒滴定以及下一代测序文库的绝对定量等应用。利用数字PCR进行绝
对定量的一般工作流程。
总之，改进的PCR实验方案和改进的DNA聚合酶旨在改善PCR扩增的结果。虽然PCR的基础概念并未发生改变，但新型PCR
方法将继续推动和简化分子生物学研究。